Screening von Hydrogelen auf antifibrotische Eigenschaften durch Implantation von Alginaten mit Zellbarcode in Mäuse und andere

Nature Biomedical Engineering Band 7, Seiten 867–886 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Das Screening implantierbarer Biomaterialien auf antifibrotische Eigenschaften wird durch die Notwendigkeit von In-vivo-Tests eingeschränkt. Hier zeigen wir, dass der Durchsatz des In-vivo-Screenings durch zelluläres Barcoding einer chemisch modifizierten kombinatorischen Bibliothek von Hydrogelformulierungen erhöht werden kann. Die Methode umfasst die Implantation einer Mischung aus Alginatformulierungen, die jeweils mit menschlichen Endothelzellen aus der Nabelschnurvene von verschiedenen Spendern versehen sind, und die Zuordnung der Identität und Leistung jeder Formulierung durch Genotypisierung einzelner Nukleotidpolymorphismen der Zellen mittels Next-Generation-Sequenzierung. Wir verwendeten die Methode, um 20 Alginatformulierungen in einer einzelnen Maus und 100 Alginatformulierungen in einem einzelnen nichtmenschlichen Primaten zu screenen, und identifizierten drei Leithydrogelformulierungen mit antifibrotischen Eigenschaften. Die Einkapselung menschlicher Inseln mit einer der Formulierungen führte in einem Mausmodell für Diabetes zu einer langfristigen Blutzuckerkontrolle, und die Beschichtung medizinischer Katheter mit den anderen beiden Formulierungen verhinderte ein fibrotisches Überwachsen. Das Hochdurchsatz-Screening von mit Barcodes versehenen Biomaterialien in vivo kann dabei helfen, Formulierungen zu identifizieren, die die Langzeitleistung von Medizinprodukten und in Biomaterial eingekapselten therapeutischen Zellen verbessern.

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Die wichtigsten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen ergänzenden Informationen verfügbar. Auf die in dieser Studie generierten Rohsequenzierungsdaten kann über Figshare unter https://figshare.com/projects/In_vivo_screening_of_hydrogel_library_using_zellulär_barcoding_identify_biomaterials_that_mitigate_host_immune_responses_and_fibrosis/144375 zugegriffen werden. Die im Rahmen der Studie generierten und analysierten Datensätze stehen auf begründete Anfrage für Forschungszwecke bei den entsprechenden Autoren zur Verfügung.

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Diese Arbeit wurde von den US National Institutes of Health (R01 DK120459 an OV und DYZ), JDRF (3-SRA-2021-1023-SB an OV) und dem Rice University Academy Fellowship (an MIJ) unterstützt. Wir danken der National Science Foundation für den Zugang zum ToF-SIMS, unterstützt durch CBET1626418. ToF-SIMS-Analysen und Spin-Coating wurden mit Unterstützung der Shared Equipment Authority der Rice University durchgeführt. Wir danken auch den Mitarbeitern der Tierressourceneinrichtung der Rice University für ihre Unterstützung bei der Tierforschung.

Sudip Mukherjee

Aktuelle Adresse: School of Biomedical Engineering, Indian Institute of Technology (BHU), Varanasi, Uttar Pradesh, Indien

David Yu Zhang

Aktuelle Adresse: NuProbe USA, Houston, TX, USA

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Sudip Mukherjee, Boram Kim, Lauren Y. Cheng.

Abteilung für Bioingenieurwesen, Rice University, Houston, TX, USA

Sudip Mukherjee, Boram Kim, Lauren Y. Cheng, Michael David Doerfert, Jiaming Li, Andrea Hernandez, Lily Liang, Maria I. Jarvis, Cody Fell, Ping Song, David Yu Zhang und Omid Veiseh

CellTrans, Inc., Chicago, IL, USA

Peter D. Rios, Sofia Ghani, Ira Joshi und Douglas Isa

Abteilung für Biomedizintechnik, Cornell University, Ithaca, NY, USA

Trisha Ray

SIMS-Labor, Shared Equipment Authority, Rice University, Houston, TX, USA

Tanguy Terlier

Abteilung für Hämatopathologie, Abteilung für Pathologie/Labormedizin, MD Anderson Cancer Center der University of Texas, Houston, TX, USA

Roberto N. Miranda

Abteilung für Transplantationschirurgie, University of Virginia, Charlottesville, VA, USA

José Oberholzer

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SM, BK, LYC, DYZ und OV haben die Studien entworfen, Daten analysiert und die Arbeit verfasst. SM, BK, LYC, MDD, JL, AH, LL, MIJ, PDR, SG, IJ, DI, TR, TT, CF, PS, JO, OV und DYZ führten die Experimente durch. SM, BK, MDD und LYC führten die statistischen Analysen durch und bereiteten Darstellungen zur Kommunikation der Datensätze vor. RNM, TT, DYZ und OV leisteten während der gesamten Zeit Beratung und technische Unterstützung, und DYZ und OV überwachten die Studie. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und die Vorbereitung der Arbeit.

Korrespondenz mit David Yu Zhang oder Omid Veiseh.

OV ist Mitbegründer und bedeutender Anteilseigner von Sigilon Therapeutics, Avenge Bio und Pana Bio. DYZ besitzt erhebliche Anteile an NuProbe Global und Torus Biosystems und erhält Beratungseinnahmen von diesen Unternehmen sowie Anteile an Pana Bio. JO ist Gründungswissenschaftler und bedeutender Anteilseigner von Sigilon Therapeutics und CellTrans Inc.

Nature Biomedical Engineering dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Links im Schema sind zwei der bisherigen triazolhaltigen Bleialginate (B1-A21 und Z1-A34) zu sehen, die in Maus- und NHP-Modellen Fibrose verhindern. Insgesamt 211 neue Alginat-Analoga wurden durch Variation des führenden hydrophilen Linkers (Azido-PEG-Amin) und des hydrophoben Linkers (Iodbenzylamin) in Kombination mit einer Reihe blau hervorgehobener Alkinklassen synthetisiert.

a: Gelierungstest von Alginat-Analoga unter Verwendung von Rhodamin B-Einschluss. b, Repräsentative Bilder der Kapselbildung unter Verwendung der Alginat-Analoga. Maßstabsleiste, 2 mm. c, Nach ersten Charakterisierungsstudien, einschließlich Reinheit, Löslichkeit und Gelbildungsfähigkeit, wurden 149 Alginatpolymere für den Screening-Test verwendet. d, Mechanische Tests (Arbeit bis zum Bersten) mit verschiedenen Alginatformulierungen. Für die statistische Analyse wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Korrektur verwendet. ***P = 0,0007 (Z1-A34), ***P = 0,0009 (B1-A51), ns; nicht signifikant für Vergleiche mit SLG20. Alle Fehlerbalken geben den Mittelwert ± Standardabweichung von n = 20 Wiederholungen an. ei, FITC-Dextran-Permeabilitätstest mit verschiedenen modifizierten Alginaten. Alle Fehlerbalken geben den Mittelwert ± Standardabweichung von n = 5 Wiederholungen an.

Die Vorbereitung der Bibliothek umfasste einen Multiplex-PCR-Schritt zur Amplifikation der SNP-Loci, einen Barcode-PCR-Schritt zum Hinzufügen eines Positions-Barcodes zu jeder Probe und ein ligationsbasiertes Sequenzierungsadapter-Änderungsverfahren. a: Vor der Optimierung betrug die Target-Rate der Bibliothek <10 %, wobei Primer-Dimere und unspezifische PCR-Produkte zum Großteil der Lesevorgänge beitrugen. b: Nach der Optimierung wurde die Target-Rate unabhängig von der geringen DNA-Eingabe (<1 ng) im Ausgangsmaterial auf >80 % erhöht.

Fastq NGS-Daten wurden durch Zeilen- und Spaltenbarcodes demultiplext, um Sequenzen, die aus derselben DNA-Eingabe amplifiziert wurden, neu zu gruppieren. Dann wurde für jede Amplikonsequenz die grep-Funktion angewendet, um die dominanten und varianten Allele zu durchsuchen und die Varianten-Allel-Häufigkeit (VAF) für jeden SNP-Locus zu berechnen. Wenn die verkapselten Zellen nur einen Spender umfassten, wurde das VAF-Profil mit den Profilen der 20 vorab gescreenten HUVEC-Spender verglichen. Der Spender mit der höchsten Übereinstimmungsrate wurde als verkapselte Spenderzelle identifiziert. Wenn ein oder zwei Spender als verkapselte Zellen verwendet wurden, wurde die Log-Likelihood aller möglichen Spenderzusammensetzungen berechnet. Die Zusammensetzung mit der höchsten Gesamt-Log-Likelihood wurde als Zellzusammensetzung bestimmt (Qualitätskontrolle für die Log-Likelihood-Analyse: 1). Mindestens 25/30 SNP-Loci hatten eine Sequenzierungsabdeckung > 50; und 2) Gesamt-Log-Likelihood höher als -200 und 3) Gütemessung höher als 10, wobei Güte als Differenz der Log-Likelihood zwischen dem wahrscheinlichsten und dem zweitwahrscheinlichsten Spenderpaar definiert ist. Das Material, das der identifizierten Spenderzelle oder Zellzusammensetzung entspricht, wäre das Material, das die Zellen einkapselt.

a: Drei verschiedene Materialien wurden getestet; UP-VLVG (Kontrolle), B1-A51 (eines der negativen Materialien) und Z1-A34 (eines der positiven Materialien). b, Schematischer Arbeitsablauf des Screenings von drei Materialien mit gemischten Doppelspendern. cd, Nach zweiwöchiger Implantation wurden jeder Maus (M1–M3) Kapseln entnommen und je nach Fibrosegrad in drei Gruppen eingeteilt. e, Repräsentatives Heatmap-Ergebnis des identifizierten Spenderpaares. f, 39 zugeordnet zu Z1-A34 (positives Kontrollmaterial), kodiert durch H16:H14 im Verhältnis 1:2; 4 auf UP-VLVG abgebildet, codiert durch H6:H8 im Verhältnis 1:2; 0 Samples sind B1-A51 zugeordnet. Insgesamt wurden 43/45 Proben aus dem SNP-Profil von 400 Spendern kartiert. Die Anteile jedes Materials, das Spenderpaaren entsprach, wurden aufgetragen, und Z1-A34 zeigte den höchsten Wert, was auf die besten immunschützenden Eigenschaften hinweist.

a: Kapseln mit menschlichen Inseln wurden mit einer endgültigen Zelldichte von 4.000, 8.000 und 16.000 IEQ/Alginatvolumen (ml) hergestellt. Die endgültigen IEQ-Werte in jeder Kapsel betrugen 10, 20 bzw. 40 IEQ pro Kapsel. In jeder Gruppe wurden 500 µL, 250 µL und 125 µL Kapseln in den IP-Raum implantiert, die insgesamt 2.000 IEQ pro Maus enthielten. Alle Fehlerbalken geben den Mittelwert ± Standardabweichung von n = 20 biologischen Replikaten an. b, Repräsentative Bilder von Z1-A34-Kapseln vor der Implantation. Eine Dithizon-Färbung weist auf lebensfähige Inseln innerhalb der Kapselmatrix hin. Nach der Einkapselung zeigen die Inseln eine gute Lebensfähigkeit (lebend: grün, tot: rot).

ab, Die Gesamtintensität von zwei durch ToF-SIMS analysierten Hauptpeaks (a, CN− und b, Br−) wurde aufgezeichnet, um sie mit dem unmodifizierten Katheter zu vergleichen. c, XPS-Daten für unmodifizierte, Met-Z1A3- und Met-B2-A17-modifizierte Katheter zeigen das Gewicht. % der für kleine Moleküle spezifischen Atome, was auf eine erfolgreiche Beschichtung hinweist. d, Repräsentative REM-Bilder von unmodifizierten und beschichteten Kathetern. z. B. Oberflächeneigenschaften von mit Leitmolekülen beschichteten Kathetern mittels Raman-Spektroskopie. Katheter vor oder nach der Implantation (4 oder 8 Wochen) wurden analysiert, um das Vorhandensein beschichteter Moleküle zu bestätigen (e, Met-Z1-A3-, f, Met-B2-A17-, g, Met-Z1-A34-Katheter). Alle Fehlerbalken geben den Mittelwert ± Standardabweichung von n = 2 Wiederholungen an.

Ergänzende Ergebnisse, Abbildungen und Tabellen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mukherjee, S., Kim, B., Cheng, LY et al. Screening von Hydrogelen auf antifibrotische Eigenschaften durch Implantation von Alginaten mit Zellbarcode in Mäuse und einen nichtmenschlichen Primaten. Nat. Biomed. Eng 7, 867–886 (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01016-2

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Eingegangen: 23. Februar 2022

Angenommen: 27. Februar 2023

Veröffentlicht: 27. April 2023

Ausgabedatum: Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01016-2

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